1、分子生物学酶切
双酶切就是在用2个酶来切啊，2个限制性酶切位点呗，因为单酶切的时候会形成本身自己切完的自我组装，相当于切了质粒的话，会形成质粒和质粒的自己重组，因为形成的粘性末端是一样的，而双酶切可以避免这个情况，在连接的时候能够更加有效的得到所需要的重组DNA，实用当然是双酶切实用啊，现在实验室基本都用这个做的。单酶切一般只是用来鉴定的，当然了单酶切切起来效率高点，简单点，但是弊端大于优点的，真实运用还是得用双酶切。 有问题可以追问，满意请，！ 单酶切就是只用一个限制性内切酶去切你的质粒，环状的质粒就成为线状的了，但质粒的大小不变 双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。
2、单酶切和双酶切的定义分别是什么？它们有什么不同？
单酶切就是只用一个限制性内切酶去切你的质粒，环状的质粒就成为线状的了，但质粒的大小不变 双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。 你该看看《生物化学》或基因工程方面的书。这都是基本的知识啊。
3、为什么要对重组质粒DNA进行双酶切
双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(
4、PCR产物和质粒双酶切后电泳如何判断酶切完成？
1、你的实验目的是什么？ 2、如果是克隆，连接T载体后不用酶切，直接转化菌落pcr检测有目的条带的话送样测序即可。 3、如果是做表达载体构建，pcr产物和质粒DNA酶切后与没有酶切的在同一块胶上电泳，如果两个酶切位点很近，几乎看不到被切下来的小片段条带（太小，早就跑出去了）。你要是怕酶切不完全就多稍加点酶，切的时间长一点。 4、关于酶切产物有几条带视酶切效果而定，酶切完全则两条，一大一小（小的可能看不到，原因见3、）酶切不完全则三条带，一大一小及未切开的pcr产物；质粒的话可能还多一条环状分子和线状分子的区别。 你是不是要把双酶切后的质粒与载体连接，而无论是PCR还是载体都无法通过电泳判断是否酶切完全，所以不好进行连接呀？对于PCR产物一般会采取这样的策略，将产物首先连接到T载体上，然后再用设计好的双酶切，电泳回收切下的条带，这样就能确保得到的是完全酶切的产物。载体判断比较麻烦，要看载体本身、多大双酶切为点之间的条带有多大、双切前后的大小是否能通过电泳区别出来，但是双切位点一般都在标记基因里面，所以插入片段的载体会在后期转化可以后区分开，所以也没有太大必要确定他是否完全，只要充分酶切就好了。 我觉得用elution buffer没太大的影响，如果你非要觉得不好的话，只能在转化一遍重新提质粒或者抽成干粉再加水。我们一般用水就行。实在不行去测序呀。 提的质粒和空质粒可以比较，如果你插入的基因足够大，实在不行多跑跑。然后看大小比较。 酶切的话还是要看你的酶的活性。要是快切酶的话只要五分钟，要是慢的话要三四个小时。（我用的是takara的） 是不是你酶切的量太少了，我一般ug以上的，还要多跑跑，跑个十分钟以上吧。 我也做了个克隆用了很长时间，实在不行就买点贵的酶，能保证一次成功呀。 这个一般酶切一到两个小时就结束。再去电泳分离，将你要的片段（根据理论大小）切胶回收。 因而你不用去判断是否酶切完成或者完全酶切开了（只要%或者以上的都切开就行了）。如果你非要百分之百的切开，可能电泳也难以检测。而且意义不大。 如果你想节省内切酶，也可以切过夜。不过如果你的质粒提的质量不高，可能让质粒降解。一般两个小时足够了。 PCR产物酶切后不能判断是否完全.. 质粒如果切下来的片断不是很小,可以取少量进行电泳查看条带..如果没有完全酶切,大条带会出现单酶切的产物条带.
5、关于实验中的酶切反应
你酶切完后要注意第一次酶切后胶回收的回收率要高，而且这样分两步做很麻烦，你不如用HindIII和EcoRI均具有较高活性的buffer，那样又快质量又高。 1、如果底物足够多，随着酶浓度增加，反应速率逐渐加快。（正比） 2、如果底物，随着酶浓度增加，反应速率先增加，后不变或下降（底物耗尽）
