1、PCR-RF-SSCP的原理？
PCRSSCP原理改进及应用 作者：mark: 随着分子生物学技术的发展， 世以后， PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成 ，局限性较大，或要实验条件 高，(下文称SSCP)作为检测基因 突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突 变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交叉污 染情况，，近几年被大量地应用. 一、SSCP的原理及特点 日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 ，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 (SingleStrand Conformation Polymorphism，SSCP)，作者又 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCRSSCP技术，进一步提高了 ;②将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 ，就可以判定该链构 象发生改变，、快速、灵敏，不需要特 殊的仪器，，只能作为一种突变检测方 法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要较严格;另外，由 于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可 能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小 时，再加上其他条件的影响， ，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱 ，经实验证明小于%可被SSCP发 现，，SSCP方 法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步 . 二、SSCP的不断改进 SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，，随着DNA 银染方法与PCRSSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP值得注意的改进是将DNASSCP分析，改为RNASSCP分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高 了检出率，其突变检出率可达%，RNA不易结合成双链，因此可以较大量 的进行电泳，;还需要一个较 长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度. 为了进一步提高SSCP的检出率， 交双链分析(Heterocluplex analysis，Het) 探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互 分析可以使点突变的检出率接近%，而且实验简便. 三、PCRSSCP的实验操作 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下: DNA片段长度(核苷酸数) (%) b b 在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾). 1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG) 按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 ，顶部加入1×TBE封闭，备用. 2)电泳 取μlPCR产物，加入μl变性剂(min，取出立刻放入冰浴中min，在紫外灯下观察，或进行银染. 3)银染法 将PAG板用去离子水洗二次，浸入% 二次，， ，. 四、SSCP的应用 自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生 有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p型基因、，Sharkar等用RNASSCP法检测了%，而DNASSCP只能检测出%，显示了RNASSCP比DNASSCP有更高的灵敏 性. SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染 情况、 进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不 仅证明了HBDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的可能性，为保证PCR诊断 ，Yap等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP 与竞争性PCR法相结合进行乳腺癌细胞突变p基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同 的扩增条件，，SSCP正在分子生物学领域 发挥着巨大的作用. 五、SSCP注意的事项 SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应 注意下列事项. ， ，但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的 结果. ②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链 的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用 (%以 上. ③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温 度下进行(一般)， 不同立体构象的单链DNA初步分离， . ④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的 影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链 上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White曾 设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发 夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出%)，说明 DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检. ⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因 此，，很难 ，以检测限为指标来判 测限则判定链
2、PCR技术的原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。这种批量复制DNA的技术就叫做PCR技术。 首先你要知道DNA复制的原理：、以dNTP为原料，由DNA聚合酶催化反应，根据碱基互补配对的原则进行复制。 然后说说PCR的原理：1、DNA双链在高温下也会变成单链（称为变性，变性温度与GC含量相关）；2、加入合成好的引物（一般由生物合成）、dNTP和DNA聚合酶（Taq酶，从Thermus aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶）可以进行DNA的体外扩增。 聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)是年美国CetusMullis等建立的最新生物技术。 PCR的原理PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两端已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸引物，这一单链引物的序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。PCR反应体系由基因组DNA、一对引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必需的离子浓度等所组成。反应在加热变性，使基因组双链DNA变性为单链(变性)后，通过降低温度使特异性引物与互补的DNA序列特异性结合(退火或称复性)，发生了互补结合的引物在耐高温的TaqDNA聚合酶作用下，以基因组单链DNA为模板，从引物端开始按“倍，一般经过周期就能扩增万倍以上。
3、PCR技术原理是什么
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至～小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 是荧光定量pcr吧 荧光定量pcr是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。 pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在dna任一一条单链上;pcr扩增时，taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信的累积与pcr产物形成完全同步。
4、下图为一PCR扩增产物电泳图，试对此实验结果做出分析评价
这个不是单一pcr产物的电泳图吧。kb还有条带？（觉得都可能大于有点像是质粒酶切的结果。。。不像是pcr产物。4、5如果是pcr产物，如果片段大小正确的话很可能就是p对了 电子从负极往正极跑，如果不注意正负极，电子就把dna带到凝胶外面去了，你只要注意电子跑动方向和你点样的是在哪一边，让电子让另外一边跑就是了。
5、PCR-RFLP检测基因多态性的机理和主要实验步骤？
基因多态性的产生原因是一个也可以是多个核酸序列有所差异，而不产生显性的生物结果． 造成的对于实验原理的影响是，该差异通常造成产生一个酶切位点的特性，而无差异则不具有，也可以是原来有，差异后消失．总之可以利用酶切来判断有无这种差异． PCR的作用主要是扩充酶切原料，所以PCR的引物设计在你下一步要切割的两侧即可，PCR通常的高效扩充大约是复制个BP的产物，当然随着现代技术的提高，也没有必要强行复合这个原则． 另外，由于将来切完了要电泳看，所以最好设计的时候切的位置不在中心．当然这点我觉得不是那么重要了． PCR完跑跑电泳试试，能清晰看到就好． 然后就内切酶来切，注意避免iplete digest,就是最好切的时间充足BUFFER浓度要正确． 切完了跑，能看出不同的，就是有差异． 举例，原本含有GGACCC，有差异的是GGGCCC，那么原本的不能被APAI 切，有差异的能． PCR复制，不管是啥，把这段争议的包含在里面，然后APAI切了跑．比如说复制 如果完全不切，只见，那就是没差异序列存在． 如果既有， 那么就可能是一个序列有，另外一个无．当然，也可能是酶切不彻底，要避免． 如果只有，那么就是两个序列都有． 最后基本上定论还是需要SEQUENCING来定． RFLP常常是用来SCREENING一下． 从genebank上多下载几个同源序列，blast比对分析找出它们的多态性位点。
6、PCR产物电泳试验原理
电泳检测是为了确定PCR产物是否扩增出来，是否有非特异性扩增和引物二聚体。点样时，产物与BUFFER混合带负电，通过电泳可以将长度不同的片段分开，以达到检测的目的展开全部 有可能是你的胶点样孔不整齐，就是你做胶的时候胶没有凝固好，你可以试试重新做块胶。 pcr拖带产生原因有很多，不知道楼主属于哪一种： 度 2、，不知楼主用的多少 3、模板浓度较高或者含有其他pcr抑制剂，建议稀释下模板 4、延伸时间一般1kb/min，时间太短可能会延伸不完全 循环应该足够了
