先进的生物燃料 – 来自多年生草和其他非食用植物的纤维素生物质以及农业废弃物的液体运输燃料 – 被高度吹捧为汽油，柴油和喷气燃料的潜在替代品。同样吹捧的是通过使用微生物合成这些燃料。然而，许多用于先进生物燃料的最佳候选化合物对微生物有毒，这提出了“生产与生存”的难题。
能源部(DOE)的联合生物能源研究所(EI)的研究人员通过开发微生物外排泵库提供了解决这一问题的方法，该库显示出显着降低七种代表性生物燃料在大肠埃希氏菌工程菌株中的毒性大肠杆菌。
“利用所有可用的微生物基因组序列数据，我们生成了一个基本上没有特征的基因库，并且能够设计一种简单但高效的策略来识别外排泵，从而减轻大肠杆菌中的生物燃料毒性，从而有助于改善生物燃料生产，“负责这项研究的EI燃料合成部门的化学家Aindrila Mukhopadhyay说。
Mukhopadhyay也在劳伦斯伯克利实验室(伯克利实验室)的物理生物科学部门任命，是发表在分子系统生物学期刊上的论文的通讯作者。与Mukhopadhyay共同撰写论文的有Mary Dunlop，Zain Dossani，Heather Szmidt，Hou-Cheng Chu，Taek Soon Lee，Jay Keasling和Masood Hadi。
EI和其他地方正在进行研究工作以设计微生物，例如大肠杆菌，以经济有效的方式生产先进的生物燃料。这些燃料包括短到中等碳链醇，如丁醇，异戊醇和香叶醇，可以加仑加仑汽油代替汽油，用于当今的基础设施和发动机，与乙醇不同。由支链碳链化合物制成的生物燃料，如乙酸香叶酯和法呢基己酸酯，也优于今天的生物柴油，后者由直链脂肪酸酯制成。环烯烃，例如柠檬烯和pine烯，可以作为喷气燃料的前体。虽然已经确定了在微生物中生产这些碳化合物的生物合成途径，
“为了使微生物生物燃料生产具有成本效益，产量必须超过本地微生物耐受水平，因此需要开发耐胁迫的微生物菌株，”Mukhopadhyay说。“与生产下一代生物燃料的代谢途径的发展同时，我们提高耐受性至关重要。”
微生物采用各种策略来解决细胞毒性，但也许最有效的是外排泵，即细胞的细胞质膜中的蛋白质，其功能是将有毒物质输送出细胞。这是使用质子动力主动完成的。然而，迄今为止，很少有这些物质具有抗生物燃料类化合物的功效。
“序列化的细菌基因组包括许多外排泵，但仍然是用于工程燃料耐受性的大部分未开发的资源，”Mukhopadhyay说。“我们采用系统的方法筛选了一个主要未鉴定的异源泵库，用于工程生物燃料耐受宿主菌株。然后，我们能够证明异源泵的表达可以提高生产菌株中生物燃料的产量。”
由于革兰氏阴性菌中所有已知的耐溶剂外排泵都属于疏水/两亲外排(HAE1)家族，因此Mukhopadhyay及其同事构建了一个数据库。
来自测序细菌基因组的所有HAE1泵的ase。然后，他们进行了生物信息学筛选，以比较预测负责底物特异性的区域与TtgB的区域，TtgB是一种充分表征的耐溶剂外排泵。
“这个指标允许我们对整套泵进行排名，并选择一个代表候选基因均匀分布的子集，”Mukhopadhyay说。“为了构建文库，我们从所选细菌的基因组DNA中扩增了外排泵操纵子，将它们克隆到载体中，并将载体转化到大肠杆菌宿主菌株中。”
在一系列生存竞赛中，表现最佳的两种微生物外排泵是天然大肠杆菌泵AcrAB和来自海洋微生物Alcanivorax borkumensis的先前未表征的泵。
“我们专注于A. borkumensis泵并在一种主要微生物菌株中进行测试，以生产柠檬烯喷气燃料前体，”Mukhopadhyay说。“表达泵的微生物产生的柠檬烯明显多于没有泵的微生物，这提供了一个重要的证据，证明了外源生物燃料耐受性的外排泵也可以提高生产主体的产量。”
Mukhopadhyay和她的EI同事已经开始评估微生物外排泵用于其他重要化合物以及木质纤维素碳源中存在的抑制剂。他们还希望改进现有库中的A. borkumensis泵和其他高性能产品，并优化泵基因在工程生物燃料生产微生物菌株中表达的系统。
“我们相信，我们对生物燃料耐受机制的生物勘探策略将成为生物技术领域中一种有价值且广泛适用的工具，用于设计新的微生物生产菌株，”Mukhopadhyay说。
